Erica E Anderson1, David H Campbell2, Kelly Ezell1, Paul R Standley2 y Wade A Grow1
Una familia de factores restrictivos miogénicos, así como MyoD y miogenina, guían la miogénesis y la formación de la unión contractiva. El fenómeno orgánico de la miogenina es activado por MyoD, y una de las funciones de la miogenina es activar el fenómeno orgánico del receptor de neurotransmisores (AChR) en la unión contractiva. Las neuronas motoras liberan agrina cuando se acercan a las fibras musculares en crecimiento, lo que impulsa el grupo de AChR existentes al lugar de la formación de la unión contractiva. Hemos demostrado previamente que la exposición continua a la proteína MyoD o miogenina disminuye el grupo de AChR inducido por agrina en el cultivo de células musculares C2C12. Nuestro objetivo fue establecer de manera más específica cómo actúan MyoD y miogenina en el crecimiento. Métodos: Los cultivos de células C2C12 se expusieron a manipulaciones experimentales y anticuerpos contra MyoD y miogenina, y morfolino de miogenina. Se utilizó Endo-Porter para mejorar la captación celular de manipulaciones experimentales. Se realizaron ensayos de agregación de AChR para evaluar el impacto de la proteína o morfolino en la agregación de AChR inducida por agrina. Los Western blots acceden al fenómeno orgánico de miogenina cuando la exposición a proteína o morfolino. Resultados: Los resultados de acuerdo con este documento demuestran que una exposición tan corta como ocho horas de proteína a miogenina reducirá la agregación de AChR inducida por agrina en miotubos. Hemos demostrado previamente que algunas manipulaciones experimentales reducen el fenómeno orgánico de miogenina simultáneamente con una disminución en la agregación de AChR inducida por agrina. Estos resultados establecen mucho específicamente cómo MyoD y miogenina participan en la formación de la unión del contratista al demostrar que la exposición de proteína a MyoD reduce el fenómeno orgánico de miogenina simultáneamente con una disminución en la agregación de AChR inducida por agrina. Conclusión: Estos resultados sugieren que MyoD es crucial para la agregación de AChR inducida por agrina a través de un mecanismo que tiene la activación del fenómeno orgánico de miogenina, lo que resulta en la activación del fenómeno orgánico de AChR, Associate in Nursingd en última instancia, la producción de un nivel adecuado de AChR para la agregación de AChR inducida por agrina y la formación de la unión del contratista. Los AChR se marcaron mediante la unión de α-bungarotoxina conjugada con tetrametil rodamina (Molecular Probes). Los cultivos se incubaron en el medio que contenía toxina durante media hora a 37 °C para marcar los AChR después de 72 horas en DM. Los portaobjetos se enjuagaron tres veces con solución salina tamponada con fosfato (PBS) a temperatura ambiente, se montaron durante diez minutos con un par de paraformaldehído en PBS, se enjuagaron tres veces con PBS, se deshidrataron en alcohol de madera frío durante cinco minutos a -20 °C y se montaron en portaobjetos con lupa en medio de montaje Vectashield para luz visible (Vector Laboratories). Los grupos de AChR se visualizaron con una lupa invertida Olimbos IX70 debajo del objetivo 20X (lo que produce un aumento completo de 200X), las imágenes fluorescentes se capturaron como archivos JPG de alta resolución con una cámara Olimbos con el paquete de imágenes digitales Magnafire.Se descubrieron grupos brillantes de AChR en todos los aspectos de los miotubos en imágenes fluorescentes. Cada imagen en escala de grises se analizó utilizando la fórmula de identificación de objetos de Cell Profiler. El límite utilizado en la fórmula se definió como la intensidad fluorescente mínima que un pel debe mostrar para ser contado como parte de un grupo. La experimentación con el límite reveló que un brillo mínimo de setenta por ciento definía un pel con suficiente luz visible para ser contado como parte de un grupo, y este umbral se utilizó para todos los análisis. Para garantizar un juicio sólido y una cuantificación consistente, el límite y todos los parámetros alternativos se mantuvieron constantes en todos los grupos e imágenes. Los modelos de activación de secuencias durante la miogénesis predicen que los genes se activan consecutivamente a partir de la activación de la miogenina por MyoD. El plan inicial para la diferenciación miogénica combinó la unión de factores de transcripción y la identificación de la expresión en todo el genoma para explicar mejor el proceso de diferenciación miogénica en las células del músculo liso. Los factores restrictivos miogénicos dirigen la miogénesis y el ensamblaje de la unión de los conectores. En concreto, el modelo inicial es incontestable: en el crecimiento de los mioblastos, MyoD se dirige a los genes implicados en la especificación de las uniones y la construcción.
Palabras clave: AChR; Agrina, C2C12; expresión de secuencia; MyoD; Miogenina; unión contratista.