Revista de VIH y virus retro Acceso abierto

Abstracto

Establecimiento de un clon de ADNc de longitud completa virulento para el coronavirus del síndrome respiratorio de Oriente Medio (MERS-CoV)

Zhu Longchao

Como el clon infeccioso del MERS-CoV es una plataforma importante para estudiar la función de la proteína del virus y la interacción virus-huésped. En el presente estudio, el clon de ADNc infeccioso del MERS-CoV adaptado a células Vero (MERS-CoV-HKU) se generó con la tecnología de clonación sin costura basada en el sitio de restricción de clase II BsmBI. Su genoma se dividió en un panel de 12 fragmentos contiguos y, tras la amplificación por PCR, se flanqueó con BsmBI. Los fragmentos se ensamblaron posteriormente en cromosomas artificiales bacterianos (BAC) utilizando uniones únicas formadas por digestión de la endonucleasa BsmBI con dos rondas de clonación. Se eliminaron dos sitios de restricción BsmBI dentro del genoma mediante mutación silenciosa y se establecieron como marcador molecular de icMERS-CoV-HKU. Finalmente, se recuperó una longitud completa de MERS-CoV-HKU, en la corriente descendente del promotor CMV en BAC.

En comparación con la cepa HCoV-EMC/2012 de tipo salvaje, el MERS-CoV-HKU recuperado por el clon infeccioso mostró títulos altos en células Vero y Huh7. Mediante análisis genético, se encontró modificación genética en proteínas no estructurales (nsp2, nsp3, nsp14 y nsp16) y proteínas estructurales (Spike, ORF5 y N). Las mutaciones sinónimas se ubicaron en nsp2 (A2169C), nsp3 (C6172T, A6954G), nsp14 (C19514T), nsp16 (T21423G), S (A22367G, T24093A) y N (T29149A). Se encontraron mutaciones no sinónimas en nsp3 (C6172T, A6954G), S (C25217T) y N (A29574T), lo que conduce a la mutación de aminoácidos en nsp3 (T198I, D1702Y), S (S1251F) y N (S192T). Sorprendentemente, se encontró la inserción de tres aminoácidos 'SHY' y la deleción de cuatro nucleótidos 'TTTA' en la región S2 y ORF5, respectivamente.

Según el estudio anterior, el RBD de BatCoV-HKU4 y BatCoV-HKU25 puede reconocer el receptor DPP4 humano, pero el RBD de BatCoV-HKU5 no pudo. Para dilucidar la relación entre MERS-CoV y BatCoVs, se generaron el clon infeccioso de MERS-CoV y los clones infecciosos quiméricos de MERS-CoV en los que la región RBD de MERS se reemplazó por la de BatCoV-HKU4, BatCoV-HKU5 y BatCoV-HKU25. Se evaluó además la replicación de clones infecciosos de MERS-CoV recombinantes en líneas celulares Vero y Huh7.

Se ha demostrado que nuestro clon infeccioso recombinante MERS-CoV tiene un papel crucial en el estudio de la transmisión y patogénesis entre especies del coronavirus.