Investigación en Genes y Proteínas Acceso abierto

Abstracto

Nueva aplicación de la proteasa de la cáscara de Cucurbita maxima en detergentes

Vadivukkarasi S, Manikandan M Pavithra K y Vasudevan M

La enzima proteasa de la cáscara de Cucurbita maxima se aisló y purificó y se estudió su aplicación en la eliminación de manchas de sangre. Se encontró que el pH y la temperatura óptimos para esta proteasa recién aislada eran 7,0 y 40 °C respectivamente. El peso molecular de la proteasa aislada se determinó por SDS PAGE y se encontró que era 31 KD. Esta nueva enzima proteasa se aplicó a la tela manchada de sangre para evaluar la capacidad de eliminación de manchas de la enzima en presencia y ausencia de detergentes. A partir de los resultados, se confirma que la proteasa recién aislada elimina la mancha por completo con detergentes e incluso en ausencia de detergentes. Este estudio confirma la aplicación de la proteasa de la cáscara de Cucurbita maxima en la eliminación de manchas de sangre.
El extracto proteolítico crudo termoestable y la proteasa purificada producida por Aspergillus tamarii URM4634 se investigaron a diferentes temperaturas. Los resultados de la actividad se utilizaron para estimar la energía de activación de la reacción de hidrólisis catalizada por el extracto crudo y la proteasa purificada (E* = 34,2 y 16,2 kJ/mol), así como las respectivas variaciones de entalpía estándar de desdoblamiento reversible de la enzima (ΔH°u = 31,9 y 13,9 kJ/mol). Cuando la temperatura se elevó de 50 a 80 °C en las pruebas de actividad residual, la constante de velocidad específica de termoinactivación del extracto proteolítico crudo aumentó de 0,0072 a 0,0378 min−1, mientras que la de la proteasa purificada de 0,0099 a 0,0235 min−1. Estos valores, correspondientes a disminuciones de la vida media de 96,3 a 18,3 min y de 70,0 a 29,5 min, respectivamente, nos permitieron estimar la energía de activación (E*d = 49,7 y 28,8 kJ/mol), la entalpía (ΔH*d = 47,0 y 26,1 kJ/mol), la entropía (ΔS*d = −141,3 y −203,1 J/mol K) y la energía libre de Gibbs (92,6 ≤ ΔG*d ≤ 96,6 kJ/mol y 91,8 ≤ ΔG*d ≤ 98,0 kJ/mol) de termoinactivación. Dichos valores sugieren que esta proteasa, que demostró ser altamente termoestable en ambas formas, podría ser explotada de manera rentable en aplicaciones industriales. Hasta donde sabemos, este es el primer estudio comparativo sobre los parámetros termodinámicos de una serina proteasa producida por Aspergillus tamarii URM4634.
Las proteasas, también llamadas "enzimas de la digestión", son biocatalizadores bien conocidos. Se utilizan comercialmente en diversas industrias, como detergentes, alimentos, productos farmacéuticos, diagnósticos, etc. Se informa que el 60% del mercado total de enzimas está cubierto por la proteasa y se considera la enzima comercial más valiosa. La fuente de proteasas es enorme y las proteasas bacterianas son más significativas en comparación con las proteasas vegetales y animales debido a su rápido crecimiento y pueden manipularse genéticamente fácilmente. Sin embargo, las proteasas vegetales que tienen una especificidad de sustrato única están libres de actividades enzimáticas secundarias indeseables que están ausentes en los sistemas microbianos o animales. Esto hace que los recursos de enzimas proteolíticas de origen vegetal sean una fuente valiosa con profundas aplicaciones en la industria de las enzimas. Hay informes mínimos sobre la caracterización de las proteasas vegetales.
Por lo tanto, la ardua búsqueda de nuevas proteasas vegetales potenciales continúa para hacerlas industrialmente aplicables y rentables. En la presente investigación se seleccionó la planta Citrus decumana L. (familia Rutaceae) ya que no hay un informe disponible sobre la enzima proteasa y su caracterización. La planta seleccionada está bien documentada con sus usos medicinales: antiespasmódico, antiinflamatorio, antihemorrágico, broncodilatador, antidiabético, antihelmíntico,
desinfectante , etc. Por lo tanto, la planta parecía ser un candidato prometedor para la fuente
de proteasa que puede explotarse para sus aplicaciones biotecnológicas. Por lo tanto, el objetivo del presente estudio es caracterizar la proteasa y purificarla parcialmente de las hojas de Citrus decumana L. con vistas a que estas enzimas proteolíticas puedan comercializarse como fuente alternativa.




La proteasa alcalina de Bacillus sp. NPST-AK15 alcalófilo se inmovilizó sobre nanopartículas de sílice con núcleo magnético tipo sonajero@capa mesoporosa (RT-MCMSS) funcionalizadas y no funcionalizadas mediante adsorción física y unión covalente. Sin embargo, el enfoque de unión covalente fue superior para la inmovilización de la proteasa NPST-AK15 sobre las nanopartículas RT-MCMSS-NH₂ activadas y se utilizó para estudios posteriores. En comparación con la proteasa libre, la enzima inmovilizada exhibió un cambio en la temperatura y el pH óptimos de 60 a 65 °C y pH 10,5-11,0, respectivamente. Mientras que la proteasa libre se inactivó por completo después del tratamiento durante 1 h a 60 °C, la enzima inmovilizada mantuvo el 66,5 % de su actividad inicial en condiciones similares. La proteasa inmovilizada mostró valores de k cat y K m más altos que la enzima soluble en aproximadamente 1,3 y 1,2 veces, respectivamente. Además, los resultados revelaron una mejora significativa de la estabilidad de la proteasa NPST-AK15 en una variedad de solventes orgánicos, surfactantes y detergentes comerciales para ropa, tras la inmovilización sobre nanopartículas RT-MCMSS-NH3 activadas. Es importante destacar que la proteasa inmovilizada mantuvo una eficiencia catalítica significativa durante diez ciclos de reacción consecutivos y se separó fácilmente de la mezcla de reacción utilizando un campo magnético externo. Hasta donde sabemos, este es el primer informe sobre la inmovilización de la proteasa sobre nanopartículas de sílice con núcleo magnético tipo sonajero y cubierta mesoporosa que también desafiaron el equilibrio entre actividad y estabilidad. Los resultados sugieren claramente que el sistema de enzima inmovilizada desarrollado es un nanobiocatalizador prometedor para varias aplicaciones de bioprocesos que requieren una proteasa.