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Abstracto

Evaluación in vitro de la tableta de matriz oral complejada con beta-ciclodextrina del fármaco de clase II glipizida para el tratamiento de la diabetes mellitus

Rajesh

Abstracto

El Helicobacter pylori es una bacteria gramnegativa que fue aislada por primera vez por Marshall y Warren de la mucosa gástrica de pacientes con gastritis y úlceras pépticas. El Helicobacter pylori es la principal causa de infección crónica de la mucosa gástrica y afecta al 50% de la población mundial. Recientemente, se ha demostrado que el H. pylori causa otras complicaciones, como úlceras gástricas, inflamación duodenal y gastritis. Según la literatura, una proporción considerable de pacientes infectados por el H. pylori pueden no desarrollar enfermedades gastroduodenales y permanecer asintomáticos durante un largo período. Por otro lado, las infecciones a largo plazo aumentan el riesgo de enfermedades como el adenocarcinoma y el linfoma gástrico.

Varios estudios han confirmado que H. pylori es un agente cancerígeno definitivo. La tasa de mortalidad asociada a la infección por Helicobacter pylori se ha estimado en 1 caso por cada 34 hombres infectados y 1 caso por cada 60 mujeres infectadas. Helicobacter pylori produce una gran cantidad de ureasa (10% - 15% del peso total de la proteína), que es necesaria para la supervivencia y la patogénesis de H. pylori. Muchas enzimas reducen la acidez del entorno inmediato de H. pylori produciendo amoníaco y carbonato a partir de urea. La ureasa de Helicobacter pylori es una enzima multimérica con un peso molecular de 550 kDa, que se obtiene de dos subunidades separadas de UreA (29,5 kDa) y UreB (66 kDa). Recientemente, los investigadores se han preocupado por el desarrollo de vacunas contra las infecciones por H. pylori. Entre varios antígenos candidatos, se considera que UreB es el más eficaz, ya que la inmunización de ratones con UreB purificado da como resultado una mayor inmunogenicidad y protección, a diferencia de la urea. La selección de la ureasa como objetivo de inmunización se basa en el hecho de que las proteínas de membrana a menudo provocan una respuesta inmunitaria. En este estudio, utilizamos un programa de software de predicción con alto rendimiento para el mapeo de epítopos. Con varios epítopos específicos de linfocitos B, ubicados uno al lado del otro, este programa seleccionó el fragmento de aminoácidos del gen UreB. Además, el fragmento antigénico se expresó y purificó como una proteína recombinante de la cepa Escherichia coli BL21 (DE3). Este estudio tuvo como objetivo presentar un fragmento de UreB recombinante (rUreB) con propiedades antigénicas significativas, utilizando programas de software relevantes.

2. Objetivos

El objetivo de este estudio fue proporcionar un vector recombinante, compuesto por la región antigénica de UreB de H. pylori, utilizando los epítopos inmunodominantes del antígeno en lugar de la secuencia total y la expresión en E. coli. Además, nos propusimos determinar su antigenicidad como candidato a vacuna y evaluar su eficacia en el diagnóstico serológico de la infección por H. pylori en humanos.

3. Métodos

3.1. Preparación de bacterias, plásmidos y otros reactivos

En este estudio, se cultivó H. pylori a partir de la biopsia de pacientes dispépticos sometidos a endoscopia diagnóstica de rutina. Antes de la biopsia, se obtuvo el consentimiento informado de todos los pacientes para participar en el estudio. Las condiciones de cultivo se determinaron en función de los hallazgos de informes anteriores. Las muestras de biopsia aisladas se cultivaron en agar Brucella (Merck, Alemania), que contenía trimetoprima (5 µg/ml), vancomicina (10 µg/ml) y anfotericina B (2,5 µg/ml), suplementado con 5% de sangre de carnero.

Después de la incubación en condiciones microaerófilas durante 3 a 5 días a 37 °C (CO2: 10 %), las bacterias cultivadas se identificaron como H. pylori mediante pruebas microbiológicas de rutina, incluida la tinción de Gram, así como las pruebas de oxidasa, ureasa y catalasa. Para una evaluación adicional, utilizamos los vectores pET-32a y pBSK (Novagen Inc., EE. UU.). Además, el vector pET-32a se utilizó para producir proteínas de fusión con una etiqueta de 6-histidinas y una etiqueta de epítopo T7 N-terminal. Estos aminoácidos adicionales aumentaron el peso de la proteína producida hasta en 20 kDa. En este estudio, las enzimas de restricción y la ADN ligasa se adquirieron de Fermentas (Lituania), y la cepa E. coli DH5α (Stratagene, EE. UU.) se utilizó para la clonación inicial. Además, se transformó pET-32a recombinante (pET-32a UreB) en E. coli BL21(DE3)pLysS (Novagen, EE. UU.) como cepa hospedante de la bacteria. Para el cultivo bacteriano de rutina, utilizamos el caldo Lysogeny (caldo Luria-Bertani, LB; Sigma, EE. UU.). Los antibióticos necesarios, incluida la ampicilina (100 µg/mL) y el cloranfenicol (34 µg/mL; Sigma, EE. UU.), se agregaron al medio LB.

Resultados: Los resultados de la secuenciación por PCR fueron indicativos de la clonación del gen UreB en el plásmido recombinante. La producción de la proteína fue inducida por isopropil β-D tiogalactopiranósido (IPTG), y la proteína expresada fue purificada por diálisis, utilizando el kit Ni-NTA. Además, la proteína recombinante con un peso molecular de 42 kDa fue reconocida por anticuerpos en Western blotting.

Conclusión: La evaluación de anticuerpos fue indicativa de altas propiedades antigénicas para el fragmento inmunogénico, predichas por bioinformática inmunológica. Por lo tanto, la proteína recombinante UreB podría ser un antígeno adecuado para el desarrollo de vacunas contra H. pylori y otros kits de diagnóstico.